Bagaimanakah ORF dan penyesuai digunakan dalam pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR?

Teknologi CRISPR (dikelompokkan secara kerap merentasi Palindromic Repeats) telah merevolusikan bidang kejuruteraan genetik, yang menawarkan alat yang berkuasa untuk pengeditan genom, peraturan gen, dan kajian genomik berfungsi. Pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR adalah langkah penting dalam skrin genetik skala besar, yang membolehkan para penyelidik untuk menginterogasi fungsi gen secara sistematik di seluruh genom. Di blog ini, kami akan meneroka bagaimana bingkai bacaan terbuka (ORFs) dan penyesuai digunakan dalam pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR, dan juga memperkenalkan penawaran kami sebagai pembekal ORFS dan Adapter.

Memahami ORFS dalam pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR

Bingkai bacaan terbuka (ORFs) adalah bahagian -bahagian urutan DNA gen yang boleh diterjemahkan ke dalam protein. Dalam konteks pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR, ORF memainkan peranan penting dalam skrin fungsi - fungsi (GOF). Skrin -skrin ini bertujuan untuk mengenal pasti gen yang, apabila overexpressed, memberikan fenotip tertentu, seperti peningkatan percambahan sel, penentangan terhadap ubat, atau morfologi sel yang diubah.

Untuk membina perpustakaan GOF berasaskan CRISPR, ORFs pertama kali diasingkan dari perpustakaan cDNA atau disintesis de novo. ORFS kemudiannya diklonkan ke dalam vektor yang sesuai, selalunya vektor lentiviral atau retroviral, yang dapat memberikan bahan genetik secara efisien ke dalam sel sasaran. Vektor mengandungi elemen pengawalseliaan, seperti promoter, untuk memacu ekspresi ORF yang dimasukkan.

Proses pengklonan ORF ke dalam vektor biasanya melibatkan pencernaan dan ligation enzim sekatan. ORF dicerna dengan enzim sekatan tertentu, yang menghasilkan hujung serasi dengan vektor yang dicerna. Kedua -dua serpihan DNA kemudian disambungkan bersama menggunakan ligase DNA, membentuk plasmid rekombinan. Plasmid ini boleh dikuatkan lagi dalam bakteria dan kemudian dibungkus ke dalam zarah virus untuk penghantaran ke dalam sel.

Sebaik sahaja vektor yang mengandungi ORF diperkenalkan ke dalam sel, ORFs ditranskripsikan dan diterjemahkan ke dalam protein. Dengan menyaring sejumlah besar sel yang menyatakan ORF yang berbeza, penyelidik dapat mengenal pasti gen yang dikaitkan dengan fenotip yang dikehendaki. Pendekatan ini telah digunakan untuk menemui pemandu kanser baru, gen yang terlibat dalam tindak balas imun, dan pengawal selia pembezaan sel stem.

Peranan penyesuai dalam pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR

Penyesuai adalah urutan DNA pendek yang digunakan untuk mengubah suai serpihan DNA semasa pembinaan perpustakaan. Dalam konteks perpustakaan berasaskan CRISPR, penyesuai berfungsi beberapa fungsi penting.

1. Penyesuai Linker untuk Pengklonan

Apabila pengklonan ORF atau serpihan DNA lain ke dalam vektor, penyesuai penghubung boleh digunakan untuk membuat hujung serasi antara sisipan dan vektor. Sebagai contoh, jika ORF dan vektor mempunyai tapak enzim sekatan yang berbeza, penyesuai penyambung boleh direka untuk mempunyai satu hujung yang serasi dengan ORF dan yang lain serasi dengan vektor. Ini membolehkan ligation efisien memasukkan ke dalam vektor, walaupun hujung semulajadi tidak serasi secara langsung.

2. Penyesuai kod bar untuk multiplexing

Skrin CRISPR skala besar, sering diperlukan untuk pelbagai sampel atau perpustakaan. Penyesuai kod bar digunakan untuk melabelkan setiap serpihan DNA atau perpustakaan individu dengan urutan barcode yang unik. Barcode ini membolehkan pengenalpastian dan penjejakan setiap sampel semasa analisis penjujukan dan data. Sebagai contoh, dalam skrin CRISPR yang dikumpulkan, populasi sel yang berbeza atau keadaan eksperimen boleh dilabelkan dengan barcode yang berbeza. Selepas penjujukan, maklumat kod bar boleh digunakan untuk menentukan yang dibaca dimiliki oleh sampel yang membolehkan perbandingan keadaan yang berbeza dalam satu penjujukan tunggal.

3. Adapter amplifikasi untuk PCR

Penguatan PCR adalah langkah biasa dalam pembinaan perpustakaan untuk meningkatkan jumlah DNA. Adapter amplifikasi direka untuk menyebarkan ke hujung serpihan DNA dan berfungsi sebagai primer untuk PCR. Penyesuai ini juga boleh menggabungkan elemen tambahan, seperti penjujukan tapak mengikat primer atau pengenal molekul unik (UMIS). UMIS adalah urutan rawak yang ditambah kepada setiap molekul DNA semasa penyediaan perpustakaan. Mereka boleh digunakan untuk membetulkan kecenderungan penguatan PCR dan kesilapan penjujukan, meningkatkan ketepatan kuantifikasi dan analisis.

Tawaran kami sebagai pembekal ORFS dan Adapter

Sebagai pembekal utama ORF dan penyesuai, kami menawarkan pelbagai produk untuk menyokong pembinaan perpustakaan berasaskan CRISPR. ORF kami disusun dengan teliti dan disahkan untuk memastikan urutan yang tinggi dan penuh - panjang. Kami menawarkan ORF dari pelbagai spesies, termasuk manusia, tetikus, dan tikus, dan juga boleh menyediakan ORF yang disintesis adat berdasarkan keperluan pelanggan tertentu.

Penyesuai kami direka dengan ketepatan dan boleh didapati dalam format yang berbeza untuk memenuhi keperluan pembinaan perpustakaan yang pelbagai. Sama ada anda memerlukan penyesuai Linker untuk pengklonan, penyesuai kod bar untuk multiplexing, atau penyesuai penguatan untuk PCR, kami mempunyai penyelesaian yang tepat untuk anda.

Kami juga menyediakan ORF berkualiti tinggi dan penyesuai dengan prestasi yang boleh dipercayai. Sebagai contoh, kamiORFS Union Elbow 90 ° penyesuai hidraulikdireka untuk menyediakan sambungan yang selamat dan kebocoran - percuma dalam sistem hidraulik, yang juga merupakan metafora untuk sambungan yang stabil dan boleh dipercayai dalam pembinaan genetik. Kami90 ° penyesuai hidraulik siku siku larasMenawarkan fleksibiliti dalam pemasangan, sama seperti fleksibiliti yang kami sediakan dalam menyesuaikan produk kami agar sesuai dengan persediaan eksperimen yang berbeza. Dan kamiORFS SWIVEL RUN TEE TEE HIDDRAULIC FITTINGS DAN ADDDOMDikenali dengan operasi lancar mereka, sama seperti ORF dan penyesuai kami memastikan proses pembinaan perpustakaan yang lancar dan cekap.

Hubungi kami untuk perolehan dan kerjasama

Jika anda berminat dengan ORF dan penyesuai kami untuk projek pembinaan perpustakaan yang berasaskan CRISPR anda, kami menjemput anda untuk menghubungi kami untuk perolehan dan kerjasama. Pasukan pakar kami bersedia membantu anda dalam memilih produk yang sesuai untuk keperluan khusus anda dan memberikan sokongan teknikal sepanjang proses penyelidikan anda. Sama ada anda adalah makmal akademik kecil atau syarikat farmaseutikal yang besar, kami komited untuk membantu anda mencapai matlamat penyelidikan anda dengan produk berkualiti tinggi dan perkhidmatan yang sangat baik.

Rujukan

1. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., ... & Zhang, F. (2013). Kejuruteraan Genom Multiplex menggunakan sistem CRISPR/CAS. Sains, 339 (6121), 819 - 823.
2. Shalem, O., Sanjana, NE, & Zhang, F. (2014). Genomik fungsional yang tinggi - menggunakan CRISPR - CAS9. Ulasan Alam Genetik, 15 (8), 591 - 603.
3. Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM, & Lander, ES (2014). Skrin genetik dalam sel manusia menggunakan sistem CRISPR - Cas9. Sains, 343 (6166), 80 - 84.